تاریخ بروزرسانی : 1398/11/09
نام بسته درسی : کشت سلول و بافت گیاهی
————————————————————————-
فهرست:
کلیات
1-1- مقدمه
1-2- دورنمای تاریخی
1-3- پیشرفتهای کشت بافت و سلول گیاهی در ایران
1-4- مزایای کشت بافت و سلول گیاهی
تجهیزات و روشهای متداول
2-1- کلیات
2-2- مشخصات آزمایشگاه کشت بافت
2-3- ضدعفونی کردن وسایل و تجهیزات
2-4- فضای انجام کار
محیط کشت غذایی
3-1- کلیات
3-2- انواع محیط کشت
3-3- مواد تشکیلدهندة محیط کشت
3-4- تهیه و ضدعفونی کردن محیط کشت
ریزنمونهها
4-1- کلیات
4-2- عوامل آلودگی و ضدعفونی ریزنمونهها
4-3- انتقال ریزنمونهها به محیط کشت
4-4- شرایط نگهداری کشتها
4-5- قهوهای شدن کشتها
4-6- دستورالعملها
تنظیمکنندههای رشد
5-1- کلیات
5-2- آثار متقابل بین هورمونها
رشد کشتهای کالوس و سوسپانسیون سلولی
6-1- کلیات
6-2- انواع کالوس
6-3- نگهداری کشتهای کالوس
6-4- ایجاد کشتهای سوسپانسیون سلولی
باززایی کشتهای بافت
7-1- کلیات
7-2- ایجاد جنینهای رویشی
7-3- القای باززایی در کشتهای بافت
7-4- کاهش قابلیت تمایز در کشت بافت
7-5- نشانههایی از توانایی باززایی
7-6- حفظ و نگهداری گیاهچههای باززا شده
7-7- ریشهزایی و انتقال گیاهچههای باززا شده به خاک
باززایی گیاه از راه کشتهای سوسپانسیون جنینزا
8-1- کلیات
8-2- تولید کشتهای سوسپانسیون جنینزا
8-3- موارد استفاده کشتهای سوسپانسیون جنینزا
کشت هاپلویید
9-1- کلیات
9-2- کشت سلولهای جنسی نر
9-3- کشت سلولهای جنسی ماده
9-4- دورگگیری بینگونهای و بینجنسی
9-5- تولید گیاهان هاپلویید مضاعف
9-6- مقایسة روشهای تولید هاپلوییدی
9-7- موارد استفاده هاپلوییدها
کشت پروتوپلاست
10-1- جداسازی پروتوپلاست از بخشهای مختلف گیاه
10-2- پلاسمولیز اولیه و حذف دیوارة سلولی
10-3- کشت پروتوپلاست
10-4- نقش و اهمیت امتزاج پروتوپلاست در اصلاح نباتات
تنوع سوماکلون
11-1- کلیات
11-2- منبع تنوع سوماکلون
11-3- انتخاب سوماکلونها
11-4- آزمون نتاج سوماکلونها
11-5- کاربرد تنوع سوماکلون در اصلاح نباتات
گزینش سلولهای گیاه برای صفات مطلوب
12-1-نمودار پاسخگویی غلظت بازدارنده
12-2- گزینش برای تحمل شوری
12-3- گزینش برای مقاومت به عوامل بیماریزا یا سمی
نگهداری و حفاظت ژرمپلاسم در شرایط انجماد
13-1- کلیات
13-2- کاهش سرعت رشد سلولها و بافتها
13-3- جلوگیری از رشد سلولها و بافتها به وسیلة نگهداری در شرایط انجماد
متابولیتهای ثانویه
14-1- کلیات
14-2- تأثیر شرایط کشت بر تهیة فراوردههای ثانویه
14-3- گزینش لاینهای سلولی با عملکرد زیاد
14-4- دستورزی ژنتیکی کشتهای بافت
ریز ازدیادی
15-1- منبع ریزنمونه برای ریزادزدیادی
15-2- موارد ویژة ریزازدیادی پس از مرحله کشت بافت
15-3- مزایا و معایب ریزازدیادی
دستورزی ژنتیکی
16-1- کلیات
16-2- راهبرد تراریختی گیاهان به روش انتقال ژن
16-3- تراریختی وابسته به کشت بافت با استفاده از آگروباکتریوم تومفسینس
16-4- تراریختی مستقل از کشت بافت با استفاده از آگروباکتریوم تومفسینس
16-5- تراریختی وابسته به کشت بافت بدون استفاده از آگروباکتریوم تومفسینس
16-6- صفات مرتبط با مهندسی ژنتیک در گیاهان
منابع
کلیات
1-1- مقدمه
فناوری کشت بافت و سلول در دومین انقلاب سبز، که براساس تغییر ژن و دستکاری ژنتیکی برای بهبود کیفیت و کمیت محصولات پایهگذاری شد، نقش کلیدی دارد. کشت بافت و سلول گیاهی به روشی گفته میشود که اجزای مختلف گیاه (سلول، پروتوپلاست، جنین، بافت، اندام و غیره) در شرایط آزمایشگاهی و به طور کامل سترون روی یک محیط غذایی قرار میگیرند و در شرایط محیطی مناسب نگهداری میشوند. این روش در سطح کموسعت (در مقایسه با کشتهای مزرعهای) و با استفاده از محیط غذایی مشخص و عاری از هرگونه آلودگی صورت میگیرد.
1-2- دورنمای تاریخی
توتی پوتنسی به معنای توانایی سلول زنده در ایجاد موجود کامل است. اگرچه دانشمندان نتوانستند فرضیة ارایه شده را به اثبات برسانند، امروزه این فرضیه به اثبات رسیده و جزء اصول بنیادی و اساسی کشت بافت و سلول گیاهی است.
اولین آزمایشهای کشت بافت و سلول گیاهی توسط گوتلیب هابرلند در سال 1889 روی سلولهای منفرد جدا شده از لایههای پارانشیمی نردبانی برگ، سلولهای پارانشیمی، سلولهای اپیدرمی و غلاف خارجی بعضی از گیاهان تکلپهای انجام شد. وی این مواد گیاهی را در محلول غذایی ناپ و غنی از شکر قرار داد و اگرچه سلولها زنده ماندند، او نتوانست تقسیم سلولی را در آنها القا کند.
به نظر میرسد که بافتهای تمایزیافتة مورد استفاده در کشت بافت، فقط بعضی از ترکیبات آلی از جمله تنظیمکنندههای رشدی را به مقدار بسیار محدود تولید میکنند. این در حالی است که تنظیمکنندههای رشد نقش مهمی در القای تقسیمات سلولی ایفا میکنند.
با پی بردن به وجود ویتامین B در عصارة مخمر و همچنین کشف ایندول استیک اسید (IAA)، پیشرفتهای مهمی در کشت بافت و سلول گیاهی حاصل شد. گوترت در سال 1934 دریافت که کشت کامبیوم بید و سپیدار روی محیط کشت ساده تقسیم سلولی را القا میکند ولی روند رشد آن به صورت کاهشی است. در سال 1939، گوترت و نوبکورت گزارشهای موفقیتآمیزی از کشت بافت ریشة هویج، و وایت گزارش مشابهی در مورد توتون ارائه کردند، به طوریکه سلولها توانایی رشد طولانیمدت داشتند. این گزارشها، اولین کشت بافتهای گیاهی واقعی بود و تودههای سلولی از بافتهای مریستمی به دست آمد. گوترت همچنین توانست با بهکارگیری IAA در محیط کشت، رشد بافت تمایزنیافته را در سطوح برشیافته بافتهای مختلف گیاهی القا کند. این تودة سلولی تمایزنیافته را کالوس نامیدند. آزمایشها نشان داد که تولید کالوس حاصل از هر بافت کشت شده (ریزنمونه) با تغییراتی در مورفولوژی و متابولیسم سلولها همراه است. نتایج به دست آمده نیز مؤید آن است که طبیعت این تغییرات به محیط کشت و ریزنمونه بستگی دارد.
واسیل و هیلدبرانت در سال 1965 نخستین کسانی بودند که توانستند نظریة توتیپوتنسی را ارایه شده توسط شوان و شلیدن (1838) را با باززایی گیاه توتون از یک سلول منفرد حاصل از سوسپانسیون سلولی، ثابت کنند. این محققان با اضافه کردن شیرنارگیل به محیط کشت تازه به این موفقیت دست یافتند.
ترکیبات محیط کشتهای اولیه که مورد استفاده قرار میگرفت براساس نوع تغذیة گیاهان و بافتهای آنها تهیه میشد و دارای مواد زیادی بود. ولی غلظت نمکهای مورد استفاده در معمولترین محیط غذایی (ناپ) کمتر از 200 میلیگرم بود. هلر در سال 1953 روی بافتهای هویج آزمایشهایی انجام داد و غلظت این نمکها را دو برابر کرد. نیچ و نیچ در سال 1956 در تحقیقاتی که روی آرتیشو انجام دادند غلظت نمکها را به 4 گرم در لیتر رساندند، ولی این تغییرات موجب فراهم شدن شرایط مناسب بافتهای کشت شده نگردید. بر این اساس توجه محققان به استفاده از ترکیبات پیچیدهای مانند عصارة مخمر، پروتئین هیدرولیز شده و شیر نارگیل برانگیخته شد. موراشیگ و اسکوگ براساس نتایج حاصل از تجزیة خاکستر کالوس توتون، محیط کشت جدیدی را ارایه کردند. در این فرمول جدید غلظت بعضی از نمکها تا 25 برابر محلول ناپ بود. در این ترکیب جدید مقدار نیتروژن (NO3– و NH4+) زیاد بود. کاربرد این محیط کشت جدید موجب شد که تعداد بیشتری گیاه به روش کشت بافت و سلول پاسخ مثبت دهند. باید اشاره کرد که عامل اصلی اختلاف در ترکیبات محیط کشتهای مختلف، مقدار و نوع منبع نیتروژنی است. به تازگی محققان بر این باورند که محیط کشت معرفی شده توسط این دو محقق که معروفترین محیط کشت بوده، بیش از حد نمکی است و توصیه میکنند که مقدار نمکهای کممصرف آن تا نصف مقدار ارایه شده کاهش یابد.
استفاده از قسمت نوک ساقه (مریستم) و تولید گیاه به سال 1946 بازمیگردد که بال توانست به این موفقیت دست یابد، ولی اهمیت این موضوع به منظور حذف ویروسهای گیاهی و سالمسازی آنها شناخته شده نبود. وایت در سال 1934 دریافته بود که نوک ریشههای کشت شده عاری از ویروس هستند. سپس موریل و مارتین در سال 1952 با تولید گیاهان بدون ویروس از راه کشت مریستم گیاهان کوکب آلوده به ویروس، این مطلب را تأیید کردند. این موضوع با سالمسازی ارکیدههای ویروسی توسط موریل در سال 1960 توسعه یافت. اگرچه تهیة پروتوپلاستهای گیاهی (سلولهای فاقد دیوارة سلولی) به دهة 1890 بازمیگردد (از سلولهای پلاسمولیز شده و به صورت مکانیکی تهیه شد) و امتزاج پروتوپلاستها به اولین دهة قرن بیستم نسبت داده میشود، معرفی و کاربرد آن توسط کوکینگ در سال 1960 و با استفاده از آنزیمهای هضمکنندة دیوارة سلولی انجام گرفت. تاکبه و همکارانش در سال 1971 با تولید گیاه از پروتوپلاستهای توتون توانستند خاصیت توتیپوتنسی پروتوپلاستها را به اثبات برسانند. کارلسون و همکارانش در 1972 اولین گیاه هیبرید بین گونهای را از راه امتزاج پروتوپلاستهای دو گونة توتون به دست آوردند.
کشف دانة گردة گیاه بازدانه ژینکو بیلوبا در سال 1953 توسط تولکه صورت گرفت که به تولید توده سلول منجر شد. کشت دانة گرده و تلقیح مصنوعی در محیط کشت بافت در سال 1962 توسط کانتا و همکارانش در گیاه شقایق انجام شد. در این روش کشت تخمک به همراه دانة گرده در شرایط آزمایشگاهی به منظور تولید هیبرید بین گونهای صورت گرفت. یامادا و همکارانش در سال 1963 توانستند از کشت بساک برگ بیدی، کالوس تولید کنند. در نهایت گوها و ماهشواری توانستند با کشت بساک داتوره، گیاه هاپلویید به دست آورند. بورگین و نیچ نیز در سال 1967 از این روش توتون هاپلویید تولید کردند.
به این ترتیب، اصول کشت بافت و سلول گیاهی در یک دورة تکاملی کمتر از 100 سال پایهگذاری شد. به طور کلی میتوان موارد مهم تاریخچة کشت بافت را به صورت زیر خلاصه کرد:
1962: معرفی محیط کشت MS (موراشیگ و اسکوک)؛
1964: تولید نخستین گیاه هاپلویید حاصل از گردههای گیاه داتوره (گوها و ماهشواری)؛
1967: تولید هاپلوییدهای توتون از راه کشت گرده (بورگین و نیچ)؛
1970: انتخاب جهشیافتههای بیوشیمیایی در شرایط آزمایشگاهی (کارلسون)، موفقیت در امتزاج پروتوپلاستها (پاور و همکاران)، کشف نخستین آنزیم برشی HindII (اسمیت)؛
1971: باززایی نخستین گیاه از پروتوپلاست (تاکبه)؛
1972: نخستین هیبرید بینگونهای از امتزاج پروتوپلاست در دو گونه توتون (کارلسون)؛
1973: کشف نقش سیتوکینین در شکستن دورة خواب ریزنمونههای جدا شده از انتهای ساقة گیاه ژربرا (پیریک و همکاران)؛
1974: باززایی گیاه هاپلویید اطلسی حاصل از پروتوپلاست (بیندینگ)، انتقال بیولوژیکی در کشت بافت گیاه (رینهارد)؛
1975: انتخاب کالوسهای ذرت مقاوم به قارچ هلمینتوسپوریوم (جنگنباخ و گرین)؛
1976: ایجاد ساقه از راه کشت نوک ساقه میخک نگهداری شده در شرایط انجماد (سیبرت)، امتزاج پروتوپلاستی دوگونه اطلسی (پاور و همکاران)؛
1978: دورگگیری رویشی گوجهفرنگی و سیبزمینی و تولید گیاه پومیتو (ملچرز و همکاران)؛
1981: معرفی واژة تنوع سوماکلونال (لارکین و اسکوکرافت)؛
1984: تراریختی توتون با استفاده از آگروباکتریوم و رشد موفق گیاهان تراریخت (دبلاک و همکاران)؛
1987: ابداع روش انتقال ژن به کمک تفنگ ژنی و باززایی گیاهان تراریخت (سانفورد و همکاران؛ کلین و همکاران)، نخستین تراریختی تکلپهای در مارچوبه با استفاده از آگروباکتریوم (بیتبیر و همکاران)، ریزتزریقی مستقیم DNA به داخل سلول گیاهی (میک و همکاران)؛
1990: الکتروپوریشن بافتهای گیاهی (دکیسر و همکاران)؛
1991: تولید نخستین گیاه تراریخت لاریکس به وسیله آگروباکتریوم (هونگ و همکاران)؛
1992: مهندسی متابولیک موفق آتروپا برای افزایش تولید آلکالویید (یون و همکاران)، مقاومت گیاه برنج به علفکش از طریق تراریختی پروتوپلاست به روش PEG (دوتا و همکاران)؛
1999: تولید سریع واکسنهای ویژه برای بافتهای لنفاوی به وسیله ایجاد گال در تنباکو (مک تورمیک و همکاران)، باززایی گیاه کیسه کشیش از پروتوپلاست و آمیزش رویشی با کلم (سیگاروا و همکاران)؛
2002: تولید فراوان هاپلویید مضاعف در گندم با استفاده از القای جنینزایی در میکروسپورها (لیو و همکاران)؛
2004: توسعه طرحهای جدید برای تولید متابولیتهای ثانویه (اکسامان و اینز)؛
2005: توسعه کشاورزی مولکولی به منظور تولید واکسنها و داروهای جدید از طریق گیاهان تراریخت (باروز و همکاران)؛
2006: تولید گندم تراریخت مقاوم به سفیدک پودری (زو و همکاران).
1-3- پیشرفتهای کشت بافت و سلول گیاهی در ایران
کشت بافت و سلول گیاهی در ایران کم و بیش از اوایل دهة 1970 با تحقیقات دکتر داریوش دانش در دانشگاه اصفهان و پی از آن در دانشگاههای صنعتی اصفهان، تهران و دیگر مؤسسات آموزشی و تحقیقاتی کشور شروع گردید.
1-4- مزایای کشت بافت و سلول گیاهی
روشهای اصلی برای ایجاد کالوسدهی و باززایی، شامل روشهایی است که هم کاربرد تجاری مستقیم دارند و به همان اندازه نیز امکان پژوهشهای پایهای ژنتیکی و بیوشیمیایی در سلول را فراهم میآورند. این روشها شامل انواع کشت بافت و سلولهای گیاهی، مانند بساک، تخمک (تخمدان)، بذر، جنین، ساقه، برگ، کالوس، جداسازی و پروتوپلاست و امتزاج آنها، انتخاب سلول، کشت مریستم و جوانه، و همچنین تغییر ژنتیکی سلولها و گیاهان است. نتایج حاصل از این روشها را میتوان به شرح زیر خلاصه کرد:
1ـ مهندسی بیوشیمی، که موجب رشد سلولهای گیاهی به تعداد زیاد در محیط کشت مایع میشود. بنابراین به طور بالقوه منابع مفید و مناسبتر تولیدات ثانویة گیاهی از گیاهان سالم به دست میآید؛
2ـ تولید گیاهان هاپلویید مضاعف حاصل از کشت هاپلوییدها که زمان دست یافتن به لاینها و واریتههای خالص را بسیار کوتاه میکند؛
3ـ تلاقی بین گونههای دور، به وسیلة جداسازی پروتوپلاست و امتزاج سلولهای رویشی، امکان انتقال ژن و ایجاد تنوع ژنتیکی را در محصولات افزایش میدهد؛
4ـ انتخاب سلول، تعداد افراد مورد بررسی در یک برنامه جداسازی یا غربال سلولی را به شدت افزایش میدهد. بنابراین در یک برنامه کشت بافت، با استفاده از جداسازی سلول برای مقاومت به شوری، علفکش و غیره، میلیونها سلول و نمونة متنوع در یک فضای محدود بررسی و انتخاب میشوند؛
5ـ ریز ازدیادی، با استفاده از روشهای کشت مریستم و ساقه، از مواد اولیة محدود گونههای چوبی امکان تولید انبوه افراد مشابه به دست میآید؛
6ـ تغییر ژنتیکی سلولها، موجب ورود بسیاری از اطلاعات خاص به سلولهای منفرد میشود که باززایی میشوند. در این روش، برخلاف تلاقی معمول بین دو فرد، اختلالات مهمی در مواد ژنتیکی ایجاد نخواهد شد.
تجهیزات و روشهای متداول
2-1- کلیات
مزیت اصلی استفاده از روش کشت بافت و سلولهای گیاهی نسبت به کشت معمولی گیاهان، کنترل دقیق فیزیکی و شیمیایی محیط است. به منظور دست یافتن به این کنترل، باید امکانات نگهداری وسایل آزمایشگاهی و مواد شیمیایی، تهیه محیط کشت و ضدعفونی آن، شستوشوی ظرفها و تمیز کردن مقدماتی مواد گیاهی، ضدعفونی ظرفهای آزمایشگاهی و ریزنمونهها و همچنین امکانات انجام کشت و رشد ریزنمونههای کشت شده، فراهم باشد. بدین منظور طراحی آزمایشگاه کشت بافت از اهمیت خاصی برخوردار است.
2-2- مشخصات آزمایشگاه کشت بافت
اندازه و ویژگیهای قسمتهای مختلف آزمایشگاه به نوع، عمل، هدف و مقدار فعالیت بستگی دارد. برای اینکه آزمایشگاه به خوبی انجام وظیفه کند باید امکاناتی برای آمادهسازی محیط کشت، ضدعفونی وسایل و محیط کشت، مکان نگهداری مواد شیمیایی و وسایل، شستوشوی ظرفها، محل سرد برای نگهداری مواد گیاهی و رشد کشتها وجود داشته باشد. انجام این کارها باید در مکانهای مشخص صورت گیرد.
2-2-1- آزمایشگاه عمومی
با توجه به اینکه تمیز بودن از شرایط اولیة آزمایشگاه کشت بافت است، وجود یک ظرفشویی مناسب (براساس فعالیت آزمایشگاه) از نیازهای اولیه است. استفاده از مواد مختلف شیمیایی در آزمایشگاه موجب میشود که نتوان دستورالعمل واحدی را در شستوشوی ظرفها پیشنهاد کرد. آنچه از اهمیت ویژهای برخوردار است، عاری بودن وسایل از آلایندهها است.
به طور کلی تجهیزات مورد نیاز در آزمایشگاه عمومی عبارتند از: دستگاه آب مقطرگیری، ترازوی حساس، pH متر، همزن مغناطیسی، حمام آب گرم یا سیستم کنترل دما، دستگاه میکروویو، آون، اتوکلاو، یخچال و فریزر.
در جایی که آلایندههای هوا زیاد است، اتاق برش بافت و انتقال آن در صورت امکان باید دارای سیستم تصفیة هوای کامل باشد. اگر آلایندهها کم باشد، هود انتقال کفایت میکند. زمانیکه حجم عملیات زیاد است، استفاده از محفظة استریل ضروری است. برای اغلب کشتها، هودهای معمولی با جریان هوای استریل کافی است. ظرفهای آلوده را نباید در مسیر جریان هوا قرار داد، زیرا جریان هوا سبب هدایت عوامل آلودگی به داخل آزمایشگاه میشود که مشکلات بهداشتی را به همراه دارد.
2-2-2- ظرفها و وسایل کشت
الف ـ ظرفهای پتری پلاستیکی و شیشهای با اندازههای مختلف، که ظرفهای پلاستیکی ضدعفونی شده هستند، در حالیکه ظرفهای شیشهای باید ضدعفونی شوند؛
ب ـ ظرفهای پلاستیکی و شیشهای با اندازههای مختلف، که نوع پلاستیکی آنها ممکن است ضدعفونی شده باشد. باید گفت که ظرفهای شیشهای مناسبترند، زیرا ظرفهای پلاستیکی اغلب غیرقابل اتوکلاو هستند و همچنین ممکن است متصاعدکنندة گاز اتیلن باشند که در این صورت تجمع اتیلن در ظرفهای کشت مانع رشد و نمو طبیعی گیاه میشود. مناسبترین ظرفهای شیشهای از جنس پیرکس هستند، زیرا شیشههای با جنس نامرغوب ممکن است موادی مانند سیلیس، سرب و ارسنیک آزاد کنند؛
ج ـ فلاسکهای کشت شیشهای مخروطی با دهانة گشاد (100 تا 2000 میلیلیتری)؛
د ـ لولههای آزمایش در اندازههای مختلف، که تعداد زیادی از آنها را میتوان در فضای کمی در داخل پایههای مربوطه نگهداری کرد. از طرفی به ازای هر لوله یک ریزنمونه کشت میشود که در صورت آلوده شدن آن، تنها یک نمونه از بین میرود.
ظرفهای شیشهای که جدید خریداری میشوند باید پیش از استفاده شسته شوند. ظرفهای شیشهای استفاده شده برای کشت بافت باید جدا از ظرفهای شیشهای مورد استفاده در دیگر آزمایشها نگهداری شوند و دهانة آنها را باید با ورقة آلومینیوم یا دیگر حفاظتکنندهها پوشانده تا عاری از گرد و خاک باشند.
نوشتههای تازه
آخرین دیدگاه ها